原文作者：Sarah DeWeerdt

　　从突触入手绘制大脑的工作日渐增多。但随着数据不断累积，研究人员必须找到使它们变得有用的方法。

　　2019 年 4 月，西雅图艾伦脑科学研究所。房间里有五台透射电子显微镜，三只闪亮的派对气球四处飘荡，气球是为了庆祝研究所最新取得的具有里程碑意义的研究成果——科研人员绘制了 1 立方毫米（约一粒沙子的大小）小鼠大脑组织内的 10 万个神经元及其之间的约 100 亿个连接，或者叫做“突触”。

在神经元绘制游戏 Eyewire 中，小鼠视网膜两个神经元之间的突触（蓝色的为视网膜神经节细胞；黄色的为无长突细胞）。来源：Alex Norton/Eyewire

　　这五台透射电子显微镜连续运行了五个月，采集了 25,000 张小鼠视皮层切片的逾 1 亿张图片，每张切片的厚度只有 40 纳米。随后，研究人员使用研究所开发的软件，用了大约三个月的时间将这些图像进行了三维重建。3 个气球上分别用蓝色和银色字母拼出了“2PB”（2 拍字节，相当于 200 万千兆字节），这是整个数据集的大小。30 多年的“陆地卫星计划”（Landsat missions）拍摄的地球照片也不过 1.3PB，这么看来小鼠的大脑图片简直可以说是“一沙一世界”（a world in a grain of sand）了，研究所的神经生物学家 Clay Reid 引用 William Blake 的诗句说道。

　　除此之外，还有多个类似“小鼠大脑立方毫米计划”的大脑纳米尺度连接组绘制项目正在进行中。所谓连接组，就是神经元与神经元之间的突触连接。神经科学家认为连接组图谱将能够帮助他们以前所未有的方式了解神经回路如何编码信息并指挥行动——简而言之，就是大脑是如何运行的。

　　距离该领域的终极目标——在纳米尺度上描绘完整的人类大脑连接组还有很长的路要走。人类大脑有 1015 个连接，包含约 1000 亿个神经元，这个数字几乎与银河系中恒星的数目相当。如果使用当前的成像技术，需要数十个显微镜连续工作几千年才能收集完所有的数据。

　　但是，显微镜技术的进步及图像分析专用计算机和算法的发展已大大推动了连接组学领域的进展，即便是身处其中的研究人员也对如此之高的发展速度大为惊讶。“立方毫米计划如果放在五年前，我们都会觉得太不切实际了。”Reid 说。而现在许多研究人员相信对整个小鼠大脑——体积约为 500 立方毫米——进行绘制完全有可能在未来十年内实现。如果这一计划按部就班地实现了，那么绘制体积更大的人类大脑不过是一个合理的长期目标。“今天，在突触水平上绘制人类大脑可能看起来不可思议。但如果计算能力和科学技术持续稳步发展，规模再扩大 1000 倍也不是完全不可能。”

　　从小着手

　　目前共有两个物种的连接组图谱已完成：第一个是一种线虫——秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans），完成于 1986 年【1】；第二个是一种海洋生物的幼虫——玻璃海鞘（Ciona intestinalis），完成于 2016 年【2】。这两个神经图谱均是非常出色的筛选工具。“秀丽隐杆线虫连接组图谱已经否定了许多之前提出的可能假设。”美国阿贡国家实验室的神经科学家 Bobby Kasthuri 说。如果某些关于线虫神经系统或行为的发现可以用连接组图谱轻而易举地解释，那就没有进一步研究的必要；研究人员可以尽早调整方向，探索潜在产出更高的领域。但如果连接组学无法为观察结果提供现成的解释，那意味着这是一个值得探索的主题。

　　但也有部分研究人员对目前纳米尺度连接组学所获的关注持怀疑态度。专注研究视觉系统的纽约大学神经科学家 Anthony Movshon 表示，这些连接组项目耗费了大量时间、精力和金钱，产出和投入可能不成正比。当涉及复杂大脑，譬如小鼠或人类的大脑时，“我不需要知道每个细胞、每个突触的具体连接细节，”Movshon 说，“我需要知道的是将整个体系连接起来的原则。”他认为这些数据完全可以在相对较粗略的分辨率上收集。尽管如此，纳米尺度连接组仍是许多科学家追求的目标。他们认为连接组图谱可以帮助破解精神疾病的起源，从而制定更有效的治疗方案，同时图谱还可以应用于其他许多领域，如人工智能、节能计算等。

　　雨后春笋般涌现的连接组项目

　　20 世纪 80 年代，为绘制秀丽隐杆线虫的纳米尺度连接组，英国剑桥大学的生物学家 Sydney Brenner 带领研究团队将几毫米长的线虫切成非常薄的切片，随后使用安装在电子显微镜上的胶片相机对每张切片进行了仔细的拍摄。最后研究人员根据所得的图像，不遗余力地手动追溯神经元通路以及其中涉及的连接。

　　但秀丽隐杆线虫只有 302 个神经元和大约7,600 个突触。绘制其连接组所有的手动方法显然无法用于更复杂的神经系统。因此科研人员并未认真考虑开展规模更大的项目， 直到 2004 年，两位来自德国海德堡马克斯·普朗克医学研究所的科学家——物理学家 Winfried Denk 和神经解剖学家 Heinz Horstmann 建议使用自动式显微镜对大脑组织进行切片和成像，并通过特定软件对图像进行堆叠和重建【3】。

　　将要发表的规模最大的完整纳米尺度连接组图谱之一描绘的是大小约 100 立方微米的小鼠视网膜，包含约1,000 个神经元和 250,000 个突触。德国马克斯·普朗克神经生物学研究所现任主任 Denk 和他的合作者——马克斯·普朗克脑研究所副主任 Moritz Helmstaedter 在 2013 年发表了其研究结果【4】。但是“小鼠大脑立方毫米计划”面对的是 10 万个神经元，其他类似的项目也在进行中。

　　“1 立方毫米的体积已足够了解大部分局部连接，尤其对于位于中间部分的神经元来说。” 艾伦研究所的神经科学家 Nuno da Costa 说。因此，依据小鼠大脑计划获得的图谱，科学家将能够探索完整的局部神经回路，而非单个神经元和周围稀疏的连接网络。艾伦研究所进行的研究是和美国贝勒医学院、普林斯顿大学和哈佛大学合作开展的，由美国政府资助，项目名为“皮层网络机器智能”。

　　根据“小鼠大脑立方毫米计划”目前的进展，有的研究人员预测完整的小鼠大脑的纳米尺度连接组图谱将在未来十年内产生，最终数据大小可能约 1EB（100 亿 GB）。“这个目标可能需要许多实验室合作才能实现。”哈佛大学神经科学家 Jeff Lichtman 说。“但至少这个目标是可能实现的，”他说，“这一点非常让人兴奋。”

　　其他人则继续保持谨慎的态度。美国霍华德·休斯医学研究所的计算机专家 Stephen Plaza 说，规模如此庞大的项目“将面临诸多后勤方面的挑战”。他认为在涉足鼠脑这类复杂神经系统之前，连接组学领域应该先从一些中等规模的项目入手。“在连接组学领域，我们目前仍处于学步状态。”他说。

　　Plaza 目前就负责着一个这样的项目——FlyEM，该项目旨在绘制黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）的中枢神经系统连接组图谱。其团队预计将在 2020 年初发布约三分之一黑腹果蝇大脑的数据。Plaza 希望在接下来的几年中能够进一步绘制整个中枢神经系统的连接组——包括果蝇大脑中的约 100,000 个神经元和 1 亿个连接，以及腹侧神经索（大致相当于脊椎动物的脊髓） 中类似数量的神经元和突触。

　　与此同时，Lichtman 正在研究斑马鱼（Danio rerio）连接组，并尝试着对一小块人类大脑组织进行分析——这块组织是从因为癫痫而接受脑外科手术的患者那里获得的内侧颞内取得的样本。该组织样本的体积大约也为 1 立方毫米，但考虑到人类大脑皮层的厚度，样本形状更类似平板，而不是立方体。

　　Denk 和他的同事正在绘制斑胸草雀（Taeniopygia guttata）的连接组，从这种小鸟学习歌唱的过程中，可以侧面了解人类的语言学习过程。Kasthuri 也有许多项目正在进行中。“现在我们已经有大量关于小鼠大脑神经回路的数据，我认为最好的研究方法是进行横向（跨物种）或纵向（发育过程）的比较，”他说， “最重要的信息往往来自相互比较。”

　　为此，Kasthuri 计划绘制非人灵长类动物以及章鱼（Octopus bimaculoides）大脑中的视觉中枢部分。“章鱼和人类差异非常大，但又极具智慧。”他说， “因此我非常期待将章鱼和小鼠的大脑连接组放在一起进行比较。”

　　同时，Kasthuri 还致力于绘制幼年小鼠和章鱼的完整连接组图谱——将这些尚未成熟的连接组与成年动物的连接组进行比较，有助于深入了解大脑如何从经验中学习。考虑到章鱼大脑相对较小，Kasthuri 希望能在一年内完成幼年章鱼连接组图谱的绘制。

　　轮到 AI 大显身手了

　　目前艾伦研究所的研究人员已完成了对立方毫米小鼠大脑的图像采集，并将这些数据发送给了普林斯顿大学的神经科学家和计算机科学家 Sebastian Seung。Seung 的实验室将根据图像进行三维重建，对突触进行标注，并对标本内总长约 4 千米的神经纤维进行分段描绘。

　　分段一直是连接组学研究中的限速步骤。如果采用传统手工方法，通过大量显微镜照片追溯单个神经元的纤维路径可能就需要花费数周时间。但现在，我们有了人工智能。Seung 的团队开发的机器学习算法可以逐像素地对图像进行评估，确定神经元的具体位置。

　　相比人眼，计算机的分段速度更快，能够将追踪神经元所需的时间缩短到几小时甚至几分钟。但这种分段并没有那么准确：计算机算法可能会遗漏一些神经元或将两个神经元误认为一个。因此计算机得出的重建图谱仍需要人工复核。Seung 的团队提出通过众包的方式完成复核，他们特别推出了一款名为 Eyewire 的在线游戏，游戏玩家需要找到连接组图像草稿中的错误并进行纠正。Eyewire 的执行董事 Amy Robinson Sterling 表示，自 2012 年推出以来，Eyewire 已拥有 290,000 名注册用户，这些玩家的贡献等同于 32 名全职工作人员连续工作 7 年。

“发育大脑连接组项目”（Developing Human Connectome Project）主要针对新生儿大脑中的神经纤维进行成像。来源：Max Pietsch/DHCP

　　到目前为止，玩家们一直在在追踪小鼠视网膜中的细胞，他们共帮助发现了六种神经元，并选择以古希腊神的名字对其命名。Sterling 和她的团队正在准备一个名为“Neo”的新版游戏，游戏将使用小鼠视觉皮层数据集。

　　Neo 的游戏界面将基于谷歌开发的 Neuroglancer 程序，该程序能够将平面的黑白电子显微照片转化为彩色的神经元 3D 网络。许多纳米尺度连接组绘制项目都使用该程序来对数据进行可视化处理。

　　谷歌还开发了一款神经元分段算法——泛洪算法网络，由加利福尼亚州 Google AI 的 Viren Jain 带领团队设计出来。该算法从图像中的某个点开始逐步构建结构，而非试图一下子明确所有神经元的边界。“这就有点像人们在填色书里涂色。”Jain 说。他的团队正在将该技术应用于 FlyEM 数据，并已基于珍利亚研究园区另一个团队提供的显微照片，构建了完整果蝇大脑的粗略连接组图谱。另外，他们还在用算法处理 Denk 和 Lichtman 实验室的数据。

　　“他们构建的连接组看起来真的很漂亮，”Lichtman 提到算法处理结果时说道，并指出该算法追踪神经元的速度远比他团队收集显微照片的速度快。“我们无法赶上他们的速度。”他补充道， “那是一个很棒的地方。”

　　Jain 非常谨慎地提醒说，随着项目规模逐渐扩大，分段算法必须更加精确，保证所需的人工复核工作量在可行的范围内。

　　提高图像采集精度及速度

　　与此同时，科学家也在不断改进显微镜技术，希望能以更快的速度生成更清晰、更细致的图像，为绘制哺乳动物大脑的纳米尺度连接组做准备。

　　连接组学研究中使用的传统显微镜叫做连续切片电子显微镜。研究人员将神经组织嵌入塑料中，并切成厚度和人类头发差不多的切片。接着，他们将切片放置在专用胶带条上，就和卷在卷筒上的胶片类似，然后将胶带条放入显微镜中进行拍摄。     

　　这种方法的优点是样品能够长期保存，如有需要，可以反复成像。但无论做得多么精确，切割样品都不可避免地会造成偏差，最终影响图像重建。

　　现在比较新的一种方法叫做聚焦离子束扫描电子显微镜（FIB-SEM）：使用带电离子束刮掉一层薄薄的组织样本，显微镜拍摄新暴露的表面，然后不断重复这个过程。FlyEM 项目是该方法第一次在如此大的规模上得到应用。

　　虽然 FIB-SEM 速度并不快，但它有一个非常显著的优点，那就是所产生的图像在三个维度上的分辨率是相同的，而传统方法生成的图片垂直方向上会相对粗糙。但是，组织样品在该过程中会汽化，因此无法反复成像。另外，FIB-SEM 的视野非常小，因此无法用于更大的样本。（即使是罂粟种子大小的果蝇大脑也必须进一步切成小块。）珍利亚研究园区的神经科学家 Kenneth Hayworth 开发的气体团簇离子束扫描电子显微镜（GCIB-SEM）工作方式相似，但视野较大，因此更适合于体积更大的脑组织成像。

　　GCIB-SEM 可能与多光束电子显微镜的兼容性更好，研究人员希望多束电子束同时扫描样品能够能加快图像采集速度。Lichtman 实验室使用的是由 Carl Zeiss 制造的有 61 道光束的显微镜，Denk 实验室则有 91 束，包含数百个光束、最终有望每秒采集一千万像素图像数据的电子显微镜也正在研发中。

　　挖掘数据背后的意义

　　但速度也会带来问题。如今纳米尺度连接组项目正在迅速产生大量数据，随之而来的挑战就是如何解读这些数据。“我们手边有这么多已经经过处理的数据，” Reid 说， “大量的科学家可以经常性地在这个数据集上有新的发现。而我们现在远没有那么多科研人员。”

　　另一个问题是如何将纳米尺度连接组数据与其他更大规模的神经科学项目（如人类连接组项目）联系起来。人类连接组项目对大约 1200 个研究对象的大脑进行了磁共振扫描，根据所得图像从毫米尺度了解连接大脑不同区域的神经纤维，最终绘制了名为宏观连接组的图谱。

　　“神经科学中最大的问题就是尺度。”伦敦国王学院的新生儿学家 David Edwards 说。他是发育大脑连接组项目的参与者之一，该项目主要对数百个宫内胎儿、足月儿及早产儿的大脑进行扫描。“在宏观层面、微观层面、人口学层面都有非常精彩的研究正在进行中，”David Edwards 说，“但我们没办法将不同层面的研究联系在一起。”

　　在某些方面，甚至比纳米尺度连接组更详细的新数据也在不断出现。譬如，通过连接组数据，我们只能了解突触的位置，而无法知晓其分子组成。“我认为这是我们需要填补的一项空白，”英国爱丁堡大学的分子神经科学家 Seth Grant 说， “否则就无法找到将其与基因组学之间的联系。”Grant 认为基因组学信息对于研究演化和遗传学对大脑功能产生了怎样的影响至关重要。

　　欢迎来到突触的世界。在 2018 年发表的一篇论文中，Grant 和他的团队对小鼠整个大脑中约 100 亿个突触进行了分类【5】。他们根据蛋白含量、大小和形状，共将突触分为 37 个亚型，并确定了不同大脑区域中突触亚型的分布。Grant 团队也开始着手将突触亚型与其构成的连接联系起来。“将突触组和连接组联系起来，”Grant 说，“将是未来的一大研究前沿。”