薄层色谱法(薄层色谱法的分析方法)

一.定性分析

1.用保留值定型在特定的色谱系统中，化合物的R f值是常数。将未知物质的R f值与标准物质的RF值进行比较，可以作为鉴定未知物质的依据。通过显色等方法进行定性分析和定位后，测量斑点的R f值。与同一块板上已知参考点的R f值比较，R f值一致，可以初步确定该点和参考点是同一物质。然后更换几个展开系统，如果R f值还是一样的话，可以得到更为积极的定性结论。这种定性方法适用于已知范围内的未知对象。由于R f值的重复性差，很难对其进行表征，所以常采用相对rf值RS来表征。

2.在板上表征化学反应有两种方式:①反应后生成具有特征颜色的化合物，从而鉴别反应物；②反应后形成成分不明的复杂混合物，但可根据产物的“指纹”特征进行鉴定。除上述两种定性方法外，还有车载光谱定性分析、薄层色谱与其他联用技术间接定性、薄层色谱-红外光谱与定性分析联用、薄层色谱-质谱与定性分析联用。取下分离区，洗脱，再用紫外可见分光光度法、红外分光光度法等其他方法进一步定性分析。

第二，定量分析

由于诸多因素，色谱条件的一致性很难控制。例如，样品量的准确性、显影后斑点面积的规律性和测量方法的准确性等。，使薄层色谱定量分析处于“半定量”或有限检查阶段。用薄层扫描仪等仪器直接测定定量含量更准确，也可将斑点分离后洗脱，再用紫外-可见分光光度法、气相色谱法等仪器定量。

1.用目测比较法半定量地将不同量的对照品配制成系列溶液和样品溶液，定量地涂于同一薄层上。点样时，严格控制样品量，可以使用微量点样器。显色后，用目测法比较色斑的颜色深浅和面积，得出样品的大致含量。在严格控制操作条件下，色斑的颜色和面积会随着溶解质量的变化而变化。目测对比分析的精度为±10%。

2.用洗脱法在薄层斑点线上对样品溶液进行定量，对照品称为斑点两侧的定位标记。展开后，只有两边的对照物质被着色。定位后，如果是软板，被测物质在薄板中部的区域可以被捕捉器收集；如果是硬板，可以用工具定量去除样品区，然后用合适的溶剂洗脱，再用其他化学或仪器方法定量，如重量法、分光光度法、荧光法等。使用洗脱法定量时，注意收集洗脱的空白色作为对照。定量薄层色谱要求显色斑点集中，无拖尾现象。洗脱时，需要浸泡在对被测物质有较大溶解度的溶剂中，多次洗脱，达到定量洗脱。对于一些吸附性强、洗脱困难的组分，可采用离心分离或过滤的方法进行定量洗脱。

3.薄层扫描法是指在薄层色谱中，用一定波长的光照射薄层板，扫描具有紫外或可见光吸收的斑点或经照射可激发产生荧光的斑点，用色谱法定量扫描图谱和积分值的方法。薄层扫描仪是一种直接扫描斑点以满足薄层色谱要求的分光光度计。其中常用的是双波长薄层色谱扫描仪，其结构和原理与双光束双波长分光光度计相同。下图显示了其光学系统的结构。

双光束双波长薄层扫描仪

L-光源；MC-单色仪；CH-chopper；P-薄层板；PM光电探测器

光源L(氘灯、钨灯或氙灯)发出的光被单色仪MC(由光栅和狭缝组成)分成波长不同的两束光λ1和λ2。斩波器CH交替遮断这两束光，最终在同一光路上合成，通过狭缝照射在薄板P上。如果在反射测量时，光束射到薄层板上的斑点之前的一部分光被应时窗板反射并被监测光电管接受，另一部分照射到斑点上，除一部分光被样品吸收外，散射光被反射光电管接受，两个探测器的输出信号之比被对数转换器转换为吸光度信号；如果在透射测量中用透射光电管代替反射光电管，其输出信号与监测光电倍增管的输出信号之比将进行对数转换，得到透射测量的吸光度信号。该信号可由仪器处理以获得轮廓或峰面积。

对于两种波长的选择，可以原位扫描待测斑点，根据斑点的吸收曲线，选择斑点的最大吸收峰波长作为测量波长λ s。选择点吸收光谱的基线部分，即化合物的非吸收波长作为参比波长λR，如下图所示。

斑点的吸收光谱

λ是测量波长；r是参考波长。

采用双波长扫描，从λS扫描的测量值中减去λR扫描的测量值(斑点位置空白色薄层的吸收值)，从而补偿薄层的背景不均匀性，使扫描曲线基线稳定，提高测量精度。下图是用λS475 nm和λR678 npH单波长和λS和λR双波长扫描一些胡萝卜色素化合物得到的扫描曲线。从图中可以看出，下图显示

单波长扫描和双波长扫描的比较

①双波长扫描曲线；②和③是单波长扫描曲线。